0
Wydalanie wirusa PRRS przez zakażone zwierzę odbywa się poprzez wydzielinę z nosa, ślinę, mocz, kał, krew, mleko oraz nasienie, a czas trwania okresu siewstwa zależy od rodzaju wydzieliny, wieku zwierzęcia, jego statusu immunologicznego oraz konkretnego szczepu PRRS. Wirus może utrzymywać się przez długi czas w tkance limfatycznej (opisywano nawet do 251 dni po zakażeniu w migdałkach), nawet wiele miesięcy po ustąpieniu wiremii.
W programach kontroli PRRS kluczowe jest dobranie takich rodzajów próbek i technik ich pobierania, które umożliwiają wykrycie zwierząt-nosicieli w końcowej fazie siewstwa. W tym celu preferowanymi próbkami są tkanka limfatyczna oraz ślina.
Rozwój technik pobierania płynu jamy ustnej stanowił istotny postęp w zwiększeniu zdolności wykrywania wirusa, zwłaszcza w sytuacjach niskiej prewalencji oraz w końcowych stadiach zakażenia. Jednak obecność inhibitorów w tego typu próbkach wymaga optymalnego zabezpieczenia materiału przed badaniem RT q-PCR. Dodatkowo wartości cT są często wysokie, co ogranicza możliwość uzyskania sekwencji wirusa.
Opisana kilka lat temu metoda skrobania migdałków miała istotne ograniczenie: wymagała mechanicznego uszkodzenia migdałka w celu uzyskania wysięku migdałkowego, co wykonywano przy użyciu narzędzi takich jak łyżki, co znacznie utrudniało praktyczne zastosowanie tej techniki u żywych zwierząt. W 2024 r. Peng Li (Uniwersytet Iowa) opublikował modyfikację tej metody w postaci mniej inwazyjnej techniki określanej jako tonsil scrubbing (pocieranie migdałków), która wykazała większą zdolność wykrywania wirusa w porównaniu z badaniem surowicy u zakażonych loch.
Schemat anatomiczny wskazujący obszar pobierania próbek.
Metoda ta została następnie oceniona na kilku fermach w Aragonii i Katalonii w Hiszpanii, zgodnie z protokołem opisanym przez Peng Li (2024), z pewnymi modyfikacjami. Zastosowano również cewniki inseminacyjne z gąbkową końcówką, zgodnie z opisem autora, jednak wprowadzono następujące zmiany:
- Nie stosowano gazy na końcówce cewnika.
- Zwierzę było unieruchamiane podczas pobierania próbek, aby umożliwić bezpośredni kontakt z migdałkiem, co byłoby trudne u poruszających się zwierząt.
- Próbki zbierano do probówek typu Falcon w celu dalszej obróbki.
Badanie przeprowadzono na dwóch typach ferm:
- Fermy tuczu, na których prosięta zostały naturalnie zakażone w okresie odchowu.
- Ośrodki odchowu loszek, wcześniej naturalnie zakażonych w okresie odchowu, w celu wykrycia przewlekłych nosicieli i zapobiegania wprowadzeniu wirusa podczas ich przemieszczania do ferm towarowych.
Na pierwszej fermie kojec uznano za jednostkę epidemiologiczną. Z każdego kojca wybrano pięć zwierząt, od których jednocześnie pobrano próbki krwi oraz wykonano tonsil scrubbing, a dodatkowo pobrano jedną zbiorczą próbkę płynu jamy ustnej.
Celem badania było oszacowanie zdolności wykrywania (obecność/brak) na poziomie grupy przy użyciu pul próbek krwi, wymazów z migdałków oraz płynu jamy ustnej.
Na pozostałych dwóch fermach pobierano indywidualne próbki surowicy, popłuczyn tchawiczo-oskrzelowych oraz wymazów z migdałków, a następnie porównywano wyniki analityczne dla poszczególnych zwierząt.
Pobieranie próbek metodą wymazu z migdałków.
Pobieranie próbek popłuczyn tchawiczo-oskrzelowych.
Wszystkie próbki analizowano metodą RT q-PCR, przyjmując wartości cT < 40 jako dodatnie. Porównano również stopień dodatniości (ładunek wirusa) dla poszczególnych typów próbek.
Wyniki wykazały, że wymazy z migdałków pozwalały wykryć większy odsetek grup dodatnich w kierunku PRRS (100%) w porównaniu z wymazami oro-migdałkowymi pobranymi w wieku 140 dni oraz w porównaniu z wynikami uzyskanymi z surowicy i płynu jamy ustnej (66,6%). Dodatkowo dodatnie wymazy z migdałków charakteryzowały się niższą średnią wartością cT (30,7) w porównaniu z surowicą (35,6) i płynem jamy ustnej (35,5).
Wskaźnik wykrywalności PRRSV
| Rodzaj próbki | 10 tygodni | 20 tygodni |
|---|---|---|
| Krew | 100% | 65,51% |
| Płyn jamy ustnej | 100% | 65,51% |
| Wymaz z migdałków | 100% |
Średnia wartość cT dla PRRSV
| Rodzaj próbki | 10 tygodni | 20 tygodni |
|---|---|---|
| Surowica | 23,16 | 35,67 |
| Płyn jamy ustnej | 27,00 | 37,00 |
| Wymaz z migdałków | 30,67 |
Średnia wartość cT dla PRRSV w zależności od rodzaju próbki
W badaniu przeprowadzonym na indywidualnych zwierzętach przewlekle zakażonych wskaźnik wykrywalności był wyższy w wymazach z migdałków (61,5%) w porównaniu z próbkami surowicy (7,7%) oraz popłuczyn tchawiczo-oskrzelowymi (30,8%). Średni ładunek wirusa w próbkach dodatnich był wyższy w wymazach z migdałków oraz popłuczynach tchawiczo-oskrzelowych (odpowiednio cT 34,1 i 33,0) niż w nielicznych dodatnich próbkach surowicy (cT 36,0).
| Próbka | Ujemne | Dodatnie | Średnie cT |
|---|---|---|---|
| Popłuczyny tchawiczo-oskrzelowe | 50 (33,56%) | 4 (30,77%) | 33,50 |
| Wymaz z migdałków | 46 (30,87%) | 8 (61,54%) | 34,13 |
| Surowica | 53 (35,57%) | 1 (7,69%) | 36,00 |
Zdolność wykrywania w wymazach z migdałków w porównaniu z surowicą i popłuczynami tchawiczo-oskrzelowymi
Nowa technika pobierania próbek może stanowić użyteczne narzędzie do lepszego zrozumienia dynamiki zakażenia u loch zakażonych szczepami o wysokiej zjadliwości, biorąc pod uwagę przedłużone wydalanie wirusa, obserwowane zwłaszcza w okresie okołoporodowym, oraz ich potencjalną rolę w transmisji wirusa na potomstwo.
W najbliższej przyszłości oceniana będzie jej przydatność również w innych scenariuszach, takich jak aklimatyzacja loszek, eliminacja zwierząt-nosicieli w programach eradykacji, a także zdolność do wykrywania i monitorowania innych patogenów, takich jak Mycoplasma hyopneumoniae czy wirus grypy świń.
